ИЗУЧЕНИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СВОЙСТВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК LENTINUS EDODES (ШИИТАКЕ), FOMITOPSIS OFFICINALIS (ТРУТОВИКА ЛИСТВЕННИЧНОГО) И PHALLUS IMPUDICUS (ВЕСЕЛКА)
Филиппова И.А., Разин А.Н., Волков М.Ю., Дерягина В.П., Рыжова Н.И. Задачей настоящего исследования является: 1) изучение противоопухолевых свойств грибов Lentinus edodes (Шиитаке), Fomitopsis officinalis (Трутовика лиственничного) и Phallus impudicus (Веселка) на модели перевивной аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) у мышей; 2) исследование возможных механизмов ингибирующего действия грибов: определение функциональной активности нейтрофилов крови и перитонеальных моноцитов и макрофагов, определение видового клеточного состава этих биологических жидкостей; 3) выявление возможной связи между объемом растущей опухоли и активностью одного из важных медиаторов роста опухоли – оксида азота. Методика исследования. Работа проведена на 129 мышах-гибридах F1(С57ВlxCBA) и Balb/c разводки питомника «Столбовая» РАМН. Мыши F1(С57ВlxCBA) в количестве 89 особей были разделены на 6 групп: 1 гр. – интактная группа (здоровые мыши), n=15; 2 гр. – здоровые мыши, получавшие перорально водную суспензию грибов Lentinus edodes –Шиитаке (188 мг/кг), n=15. Контролем служили мыши с подкожно перевитой аденокарциномой Эрлиха (106 клеток в 0,5 мл Хенкса), n=15 – 3-я гр. Остальные три опытные группы по 14 и15 мышей в каждой (4, 5 и 6 гр.) включали мышей с перевитой АКЭ. Мыши этих групп получали 5 раз в неделю в течение двух недель до перевивки и на протяжении всего эксперимента водную суспензию грибов в разовой дозе 15 мг/кг Трутовика или Веселки (табл. 1), или 188 мг/кг Шиитаке. Следует подчеркнуть, что мышам 4 и 5 групп первые два дня эксперимента вводили максимально переносимую разовую дозу грибов Трутовика лиственничного и Веселки, которая составляла 188 мг/кг. Действие грибов на рост перевитой опухоли по другой схеме введения действующего продукта исследовали на примере Трутовика (табл. 1а). Опыт проводили на мышах Balb/c, с общим количеством 20 животных. Контролем служили мыши с перевитой АКЭ, n=10. Мышам опытной группы, численностью 10 животных, вводили перорально водную суспензию Трутовика в дозе 18,3 мг / кг, начиная со второго дня после перевивки АКЭ и в течение всего последующего периода. Наличие возможной связи между размером опухоли в процессе ее роста и образованием нитросоединений в организме проводили также на мышах Balb/c, с общим количеством 20 животных (табл.6). Ингибирующее рост опухоли действие грибов оценивали по торможению роста опухоли (ТРО) у животных опытных групп в сравнение с контрольной группой: ТРО = [(Vк-Voп)/Vк] x 100 %; где Vк – средний объем опухоли в контрольной группе, Voп – средний объем опухоли в опытной группе (мм3). Принимая во внимание, что форма опухоли представляет собой не чисто сферическую форму и более напоминает элипсоид, объем опухоли определяли по формуле для расчета объема элипсоида: V= AxBxCx p /6, где А, В, С – длины большой, средней и малой оси. Выделение активных форм кислорода фагоцитами крови и перитонеальной жидкости (нейтрофилами, моноцитами и макрофагами) определяли по люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ), регистрируемой прибором Биолюмат, модель 9500 («Berthoold, Германия). Резидентные клетки перитонеальной жидкости получали промыванием брюшной полости раствором Хенкса в объеме 2 мл. Перитонеальные клетки осаждались на предметном стекле в термостате при температуре 37°С в течение 20 мин. После фиксации в метаноле и окрашивания их по Романовскому-Гимза определяли клеточный состав перитонеальной жидкости по морфологическим критериям. Для постановки реакции определения спонтанной (СХЛ) и фагоцитозависимой хемилюминесценции (ФЗХ) крови и клеток перитонеального содержимого смешивали 0,2 мл Хенкса + 0,1 мл люминола (0,56 мМ) + 0,1 мл крови (предварительно разведенной в 4 раза р-ром Хенкса) или 0,1 мл перитонеальной жидкости. В качестве активатора фагоцитоза использовали зимозан (0,05 мл), опсонизированный сывороткой 10-12 здоровых доноров. ХЛ измеряли в течение 30 мин, с интервалом в 5 мин. Известно, что хемилюминесцентный ответ крови и перитонеальной жидкости определяется, в основном, фагоцитирующими клетками: нейтрофилами, моноцитами и макрофагами, способными продуцировать активные формы кислорода. Учитывая это, а также исходя из клеточного состава изучаемого объекта, можно принять, что в крови уровень АФК определяется, в основном, нейтрофилами. Моноциты, присутствующие в крови в меньшем количестве и проявляющие более низкую хемилюминесцентную активность (до 10 раз), вносят меньший вклад в общий хемилюминесцентный отклик крови. Принимая это соотношение, приходим к выводу, что хемилюминесцентная активность перитонеальной жидкости, содержащей m макрофагов и n нейтрофилов эквивалентна активности m + 10 n макрофагов. Отсюда активность одного макрофага a может быть оценена (по хемилюминесцентному отклику) как частное от деления величины ХЛ/ m + 10 n. Содержание нитритов (НИ) в моче определяли методом Грисса. Нитраты (НА), при их определении, предварительно восстанавливали до НИ пористым кадмием и анализировали тем же методом. Для сбора мочи мышей помещали по 5 шт. в обменные клетки на сутки, лишив корма при свободном доступе к дистиллированной воде. Во избежание разрушения НИ в емкости для сбора мочи вносили 0,3 мл 30 % гидроксида натрия. Для удаления белково- углеводной составляющей в экстракте опухолевой ткани, перитонеальном содержимом и моче использовали водные растворы калия железистосинеродистого и цинка сернокислого. Статистическую обработку данных, представленных как среднее арифметическое значение + стандартное отклонение, проводили, используя критерий Стьюдента. Результаты и обсуждение. В табл. 1 представлены результаты действия водной суспензии грибов Трутовика, Веселки и Шиитаке на рост АКЭ в течение 31 дня наблюдения после индукции опухоли. Как видно из приведенных данных, на ранних сроках наблюдения (6-11 сутки) клетки АКЭ были чувствительны к введению всех видов грибов: Трутовика, Веселки и Шиитаке, причем Веселка вызывала наиболее выраженный ингибирующий эффект, который составил 71,0 %. Ингибирующее действие Трутовика и Шиитаке на ранней стадии развития опухоли более умеренное, максимальное снижение объема опухоли составляет 63,2 и 50,2 % соответственно. Через две недели после индукции опухоли тормозящее действие грибов Веселки и Трутовика в значительной мере сглаживается и в течение последующего периода наблюдения составляет около 10 %. В то же время, в этот период ингибирующее действие грибов Шиитаке на рост АКЭ проявляется более отчетливо, объем опухоли у мышей этой группы меньше на 14,3- 17,8 %, чем в контроле. Обращает на себя внимание выраженная межиндивидуальная чувствительность мышей к действию всех видов грибов. Так, формирование опухолевого узла на ранней стадии роста опухоли у некоторой части опытных мышей было замедленным, затем скорость роста опухоли опережала этот показатель, характерный для других животных и затем стабилизировалась на их уровне. Результаты взвешивания опухолей у мышей F1(С57ВlxCBA), забитых на 31 сутки после индукции АКЭ, показывают, что среднеарифметическое значение массы опухолей у мышей, которым вводили грибы Трутовик, Веселку, Шиитаке, было меньшим по сравнению с контролем на 14,3 %, 12,7 % и 26,2 %, соответственно (табл. 1). Но статистически достоверным снижение массы опухоли было лишь у мышей с АКЭ, которым вводили грибы Шиитаке (р=0,02). Анализ данных лейкоцитарного состава клеток крови у мышей в конце эксперимента (табл.2) показывает, что мыши с АКЭ характеризуются более высоким уровнем количества лейкоцитов по сравнению с мышами интактной группы, причем у мышей, потреблявших грибы, этот показатель близок к показателю интактной группы. Наряду с этим, в крови животных с опухолью наблюдается достоверное увеличение относительного количества нейтрофилов и снижение доли лимфоцитов, а введение грибов практически не меняет эту тенденцию. Данные определения функциональной активности нейтрофилов в крови по выделению активных форм кислорода в хемилюминесцентном тесте (табл. 3) показывают выраженное возрастание активности клеток при стимулировании их зимозаном у мышей с АКЭ. Введение грибов Шиитаке мышам с АКЭ приводит к существенному достоверному снижению в 3,4 раза активности полиморфноядерных лимфоцитов в направлении уровня ее как у здоровых мышей. Введение Шиитаке здоровым мышам не изменяло активность нейтрофилов в спонтанном состоянии и при их стимулировании зимозаном. Определение клеточного состава перитонеального содержимого мышей (табл. 4) показывает, что введение здоровым мышам грибов Шиитаке (188 мг/кг) на протяжении 45 дней приводит к достоверному в 2,4 раза повышению общего количества клеток. Увеличение количества клеток в перитонеальной жидкости здоровых мышей при введении грибов происходил, в основном, за счет возрастания доли и абсолютного количества лимфоцитов, а также моноцитов и макрофагов. Увеличение общего количества клеток в 2,1 раза в сравнении с животными интактной группы присуще и мышам с АКЭ, не потреблявших грибы. В то же время, у мышей с АКЭ, которым регулярно вводили суспензию грибов Шиитаке, наблюдали нормализацию этого иммунологического показателя до уровня как у здоровых мышей. У животных с АКЭ видовой состав клеток перитонеального содержимого (соотношение макрофагов, нейтрофилов, тучных клеток, лимфоцитов) отличается существенным возрастанием относительного количества нейтрофилов в 26,7 раза и одновременным снижением относительного количества лимфоцитов в 1,2 раза. Введение грибов снижало долю нейтрофилов и достоверно увеличивало долю моноцитов и макрофагов в перитонеальном содержимом мышей с АКЭ (табл. 4). Измерение ХЛ макрофагов перитонеального содержимого у мышей (табл. 5) выявило снижение активности моноцитов и макрофагов в спонтанном состоянии у мышей с АКЭ (в 4 раза) и у здоровых мышей, получавших грибы (в 2,9 раза). Наряду с этим, при стимуляции клеток перитонеальной жидкости зимозаном у мышей с АКЭ отмечается достоверный рост активности моноцитов и макрофагов. Мыши с АКЭ, потреблявшие грибы, имели повышенную активность моноцитов и макрофагов перитонеального содержимого как в спонтанном состоянии, так и при их стимуляции, соответственно, в 5,1 и 1,7 раза по сравнению с этим показателем для мышей с АКЭ. Результаты определения нитритов (НИ) и нитратов (НА) в моче мышей Balb/c в течение роста перевитой АКЭ (табл. 6) отражают интенсивность их эндогенного образования в организме. Источником эндогенного образования НИ и НА является оксид азота, продукт активности NO-cинтаз (конститутивной и индуцибельной). Оксид азота, окисляясь, образует более стабильные соединения – НИ и НА. Полагают, что интенсивность образования оксида азота в организме может характеризовать скорость опухолевого роста. Как видно из данных табл. 6, наблюдается прямая корреляционная зависимость между уровнем суточного выделения нитритов и нитратов с мочой и объемом АКЭ. За 28 суток наблюдения с момента появления оформленных опухолевых узлов (4 сутки) содержание нитритов и нитратов в моче возросло, соответственно, в 3,6 и 65,3 раза, а объем опухоли увеличился в 67,3 раза. В табл. 1а приведены данные действия водной суспензии Трутовика на рост АКЭ у мышей Balb/c. Схема введения суспензии Трутовика отличалась от предыдущей. Суспензию Трутовика в дозе 18,3 мг/кг м.т.ж. стали вводить на второй день после перевивки АКЭ и вводили в течение всего эксперимента с частотой 5 раз в неделю. Как видно, объем опухоли у мышей, получавших грибы Трутовик, был на уровне контроля, либо несущественно ниже его (на 5,1- 17,5 %). Следовательно, при такой схеме введения и такой дозе, грибы не оказывают тормозящего действия на рост опухоли. Таким образом, результаты экспериментального исследования показывают, что гриба Веселки, Дождевик и Шиитаке, введенные до перевивки АКЭ, вызывают на ранней стадии развития АКЭ торможение роста опухоли и этот эффект более отчетливо проявляется при введении грибов Веселка 71 % по объему опухоли). Следует обратить внимание на то, что доза грибов (Веселка и Трутовик), вводимых в течение первых 2 дней эксперимента, была максимально переносимой (188 мг/кг), в дальнейшем она была снижена до 15 мг/кг. На первой стадии рост опухоли у мышей F1, получавших грибы, независимо от их вида, был неравномерен, отмечалась выраженная межиндивидуальная чувствительность к действию грибов. Но в дальнейшем, ингибирующий эффект действия Веселки и Трутовика слабел, в то время как умеренное ингибирующее действие Шиитаке сохранилось до конца наблюдения (31 сутки) и составило 26,2 %. Рост опухоли у мышей всех групп сопровождается увеличением количества лейкоцитов в крови с одновременным увеличением относительного количества нейтрофилов. У животных с опухолями усилены свободнорадикальные процессы: стимулировано образование активных форм кислорода нейтрофилами крови, моноцитами и макрофагами перитонеальной жидкости и нитросоединений: НИ и НА в организме. Введение грибов Шиитаке здоровым животным приводило к увеличению общего количества клеток в перитонеальном содержимом, прежде всего, за счет лимфоцитов, моноцитов и макрофагов. Поступление грибов Шиитаке в о ганизм мышей с АКЭ снижает активность нейтрофилов крови, повышенный у животных с опухолью, практически до уровня активности этих клеток у здоровых животных. Одновременно у мышей с АКЭ действие грибов Шиитаке привело к нормализации показателя уровня общего количества иммунокомпетентных клеток в перитонеальном содержимом и скорректировало его видовой состав в сторону, характерную для здоровых животных. В то же время, введение грибов Шиитаке мышам с АКЭ приводит к усилению активности моноцитов и макрофагов перитонеальной жидкости. Выводы. Результаты исследований на мышах-гибридах F1(С57ВlxCBA) по выявлению ингибирующего действия грибов Шиитаке на рост перевитой АКЭ согласуются с результатами, полученными ранее в эксперименте на мышах линии C57Bl (отчет №1). Полученные новые данные подтверждают наличие умеренных ингибирующих свойств у грибов Шиитаке. Грибы Веселка и Трутовик также проявляют способность ингибировать рост АКЭ на ранних стадиях роста опухоли, однако в дальнейшем влияние грибов на рост опухоли в существенной мере убывает. На основании проведенных исследований можно полагать, что грибы Шиитаке обладают иммуномодулирующим действием: активируют звено неспецифической противоопухолевой защиты – усиливают активность моноцитов и макрофагов без стимуляции и при стимуляции этих клеток активаторами, имеющими разную природу. Наряду с этим, при опухолевом росте грибы Шиитаке способны регулировать в сторону нормализации такие показатели, как общее количество иммунокомпетентных клеток в перитонеальном содержимом и функциональную активность полиморфноядерных лейкоцитов крови. Данные экспериментов дают основание предположить, что действие грибов Шиитаке, Веселки и Трутовика эффективно лишь при схеме, включающей обязательное введении грибов в течение определенного времени до перевивки АКЭ. Табл. Стр. 26,27,28,29,30 Таблица 1 Влияние водной суспензии Трутовика лиственничного, Веселки, Шиитаке на рост опухоли у мышей F1(С57ВlxCBA) с подкожно перевитой АКЭ
